Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí bằng thạch Plate Count Agar

Phạm vi

Phương pháp dùng để đếm vi sinh vật có khả năng mọc và tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch trong điều kiện hiếu khí ở 30 °C. Ứng dụng cho thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và mẫu môi trường khu vực sản xuất. Ghi chú này tóm tắt các bước chính, phòng thí nghiệm cần tham chiếu bản đầy đủ của ISO 4833-1 khi xây dựng quy trình nội bộ.

Môi trường Plate Count Agar

Thành phần điển hình cho 1 lít:

Chuẩn bị môi trường

1. Hoà tan môi trường khô theo lượng ghi trên nhãn của nhà sản xuất (thường khoảng 23,5 g/L) trong nước cất.
2. Đun sôi để agar tan hoàn toàn.
3. Hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 15 phút.
4. Để nguội và giữ trong bể ổn nhiệt ở 44–47 °C cho đến khi đổ đĩa. Không giữ môi trường ở trạng thái lỏng quá 4 giờ.

Pha loãng mẫu

1. Đồng nhất 10 g mẫu với 90 mL dung dịch pha loãng (nước pepton muối hoặc nước pepton đệm) để được độ pha loãng 10⁻¹.
2. Từ dịch 10⁻¹, pha loãng thập phân liên tiếp: 1 mL dịch vào 9 mL dung dịch pha loãng.
3. Chọn các độ pha loãng sao cho dự kiến có từ 10 đến 300 khuẩn lạc trên đĩa.

Đổ đĩa và ủ

1. Hút 1 mL mỗi độ pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng.
2. Đổ khoảng 15 mL PCA ở 44–47 °C vào đĩa, xoay nhẹ để trộn đều mẫu với môi trường.
3. Để thạch đông trên mặt phẳng. Có thể phủ thêm một lớp thạch mỏng để hạn chế khuẩn lạc lan.
4. Lật ngược đĩa và ủ ở 30 ± 1 °C trong 72 ± 3 giờ.
5. Kèm theo mỗi mẻ một đĩa trắng môi trường và một đĩa trắng dung dịch pha loãng để kiểm soát nhiễm.

Tính kết quả

Đếm khuẩn lạc trên các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc. Khi dùng hai độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ một đĩa:

N = ΣC / (V × 1,1 × d)

• ΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa
• V: thể tích cấy vào mỗi đĩa (mL)
• d: độ pha loãng của dịch thứ nhất được giữ lại

Kết quả biểu thị bằng CFU/g hoặc CFU/mL, làm tròn hai chữ số có nghĩa.

Lưu ý về chất lượng

• Kiểm tra hiệu năng mỗi lô môi trường bằng chủng chuẩn trước khi dùng.
• Ghi số lô và hạn dùng của môi trường trong sổ theo dõi.
• Bảo quản môi trường khô ở nơi khô ráo, đậy kín nắp sau khi mở vì môi trường hút ẩm dễ vón cục.