Kháng sinh đồ khuếch tán đĩa là phương pháp đơn giản, rẻ và vẫn được dùng nhiều ở các phòng xét nghiệm. Cách làm thì dễ, nhưng kết quả lại rất nhạy với những chi tiết nhỏ như độ dày thạch hay độ đục huyền phù. Vì vậy hai phòng làm cùng một chủng có thể ra hai kết quả khác nhau.
Cơ chế khá trực quan. Đĩa giấy tẩm kháng sinh đặt lên mặt thạch đã cấy vi khuẩn. Kháng sinh ngấm ra xung quanh, càng xa đĩa nồng độ càng thấp. Nếu vi khuẩn nhạy thì quanh đĩa có một vòng không mọc. Đo đường kính vòng rồi tra bảng của CLSI hoặc EUCAST để biết chủng đó nhạy, trung gian hay kháng.
Thạch Mueller-Hinton được chọn làm môi trường chuẩn vì thành phần ổn định giữa các lô và ít chất cản trở sulfonamid, trimethoprim.
Đổ thạch
Cân bột theo hướng dẫn trên nhãn (thường khoảng 38 g cho 1 lít), đun sôi cho tan hết, hấp 121 °C trong 15 phút rồi để nguội xuống khoảng 45 đến 50 °C.
Phần quan trọng nhất là độ dày: thạch phải dày 4 mm, tương đương khoảng 25 mL cho đĩa 90 mm. Thạch mỏng làm vòng to hơn thực tế, thạch dày làm vòng nhỏ đi. Chúng tôi khuyên dùng ống đong hoặc máy rót để lấy đúng thể tích cho mỗi đĩa, không nên rót ước lượng bằng mắt.
Thạch đông xong thì kiểm tra pH, đạt khoảng 7,2 đến 7,4 là được. Đĩa cất ở 2 đến 8 °C trong túi kín và dùng trong một tuần. Trước khi cấy, để mặt thạch ráo, không còn giọt nước đọng.
Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn
Lấy 3 đến 5 khuẩn lạc giống nhau trên đĩa cấy 18 đến 24 giờ, hoà vào nước muối sinh lý NaCl 0,85% vô trùng hoặc canh thang TSB. Chỉnh độ đục bằng 0,5 McFarland, tương đương khoảng 1,5 × 10⁸ CFU/mL. Có thể so bằng mắt với ống chuẩn trên nền kẻ sọc đen trắng, hoặc đo bằng máy đo độ đục nếu phòng có.
Huyền phù đã chỉnh phải dùng trong vòng 15 phút.
Cấy và đặt đĩa
Nhúng tăm bông vô trùng vào huyền phù, ép bớt dịch vào thành ống. Quét kín mặt thạch, xoay đĩa khoảng 60 độ rồi quét lại, làm ba lần như vậy, cuối cùng quét một vòng quanh mép. Để mặt thạch khô 3 đến 5 phút.
Đặt đĩa kháng sinh bằng kẹp vô trùng hoặc dụng cụ dập đĩa, ấn nhẹ để đĩa áp sát mặt thạch. Đặt rồi thì không được xê dịch, vì kháng sinh đã bắt đầu ngấm ra ngay khi đĩa chạm thạch. Các đĩa cách nhau ít nhất 24 mm tính từ tâm và cách mép đĩa petri 10 đến 15 mm. Với đĩa 90 mm, không đặt quá 6 đĩa kháng sinh.
Ủ và đọc
Lật ngược đĩa và đưa vào tủ ấm 35 ± 2 °C trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa kháng sinh. Ủ 16 đến 18 giờ.
Đọc ở mặt sau đĩa, đặt trên nền tối, đo đường kính vòng bằng thước kẹp (đo cả phần đĩa giấy). Với phần lớn kháng sinh, có thể bỏ qua các khuẩn lạc li ti sát mép vòng. Một số trường hợp bảng điểm gãy có hướng dẫn riêng thì làm theo bảng. Phòng xét nghiệm nên dùng thống nhất một hệ thống, hoặc CLSI M100 hoặc EUCAST, và dùng phiên bản mới nhất.
Kiểm chuẩn và xử lý khi không đạt
Mỗi lô thạch mới hoặc lô đĩa kháng sinh mới đều phải thử với chủng chuẩn, thường là E. coli ATCC 25922 và S. aureus ATCC 25923. Đường kính vòng phải nằm trong khoảng cho phép đã công bố.
Khi kết quả kiểm chuẩn lệch, chúng tôi thường dò theo thứ tự sau:
| Hiện tượng | Nguyên nhân thường gặp |
|---|---|
| Vòng to ở hầu hết kháng sinh | Thạch mỏng, huyền phù loãng |
| Vòng nhỏ ở hầu hết kháng sinh | Thạch dày, huyền phù đặc, ủ quá giờ |
| Chỉ aminoglycosid cho vòng nhỏ | pH thạch thấp hoặc Ca²⁺, Mg²⁺ không đạt |
| Tetracyclin cho vòng to | pH thạch cao hơn 7,4 |
| Mọc loang lổ | Quét chưa kín, mặt thạch còn ướt |
Khi làm với vi khuẩn gây bệnh, thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II. Đĩa và tăm bông đã dùng phải hấp tiệt trùng trước khi bỏ.
Kỹ thuật viên TC-Chem hỗ trợ qua hotline 0942.592.312 hoặc Zalo.