Tổng quan
Trong HPLC pha đảo, pha động thường là hỗn hợp nước với methanol hoặc acetonitril. Hai dung môi này cho độ chọn lọc khác nhau, nên thay đổi dung môi là một cách hiệu quả để tách các pic bị chồng lên nhau.
So sánh nhanh
| Tiêu chí | Methanol | Acetonitril |
|---|---|---|
| Ngưỡng hấp thụ UV | khoảng 205 nm | khoảng 190 nm |
| Độ nhớt hỗn hợp với nước | cao hơn, áp suất cột lớn hơn | thấp hơn |
| Độ mạnh rửa giải (pha đảo) | yếu hơn ở cùng tỉ lệ | mạnh hơn |
| Tính chất | dung môi phân cực có proton, tạo liên kết hydro | dung môi phân cực không proton |
| Giá thành | rẻ hơn | cao hơn, dễ biến động |
Khi nào chọn acetonitril
- Phát hiện UV ở bước sóng thấp (dưới 210 nm), cần đường nền ổn định.
- Cột hạt nhỏ hoặc hệ UHPLC cần giữ áp suất thấp.
- Chạy gradient nhanh, cần thời gian cân bằng ngắn.
Khi nào chọn methanol
- Phương pháp tiêu chuẩn đã quy định methanol.
- Cần độ chọn lọc khác để tách các hợp chất phenol, axit hữu cơ hoặc đồng phân.
- Muốn giảm chi phí cho các phương pháp chạy nhiều mẫu.
Hỗn hợp methanol và nước có độ nhớt lớn nhất ở khoảng 40–50% methanol. Khi chạy gradient qua vùng này, áp suất tăng đáng kể. Kiểm tra giới hạn áp suất của cột trước khi chuyển phương pháp.
Chuẩn bị pha động
- Dùng dung môi cấp HPLC hoặc gradient và nước siêu sạch.
- Lọc pha động chứa muối đệm qua màng 0,45 µm (hoặc 0,22 µm với UHPLC).
- Đuổi khí bằng siêu âm hoặc dùng bộ đuổi khí online.
- Pha đệm mới hằng ngày, không để đệm phosphat trong dung môi hữu cơ tỉ lệ cao vì muối có thể kết tủa.
Chuyển phương pháp giữa hai dung môi
Độ mạnh rửa giải không tương đương theo tỉ lệ 1:1. Một cách ước lượng thường dùng là tỉ lệ methanol cần khoảng 10% cao hơn acetonitril để có thời gian lưu tương tự, sau đó tinh chỉnh bằng thực nghiệm và thẩm định lại phương pháp.
Cần tư vấn thêm về phương pháp hoặc sản phẩm?
Kỹ thuật viên TC-Chem hỗ trợ qua hotline 0942.592.312 hoặc Zalo.
Gửi yêu cầu báo giáKỹ thuật viên TC-Chem hỗ trợ qua hotline 0942.592.312 hoặc Zalo.