Pha đệm phosphate cho pha động High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Trong các phương pháp HPLC pha đảo của dược phẩm và thực phẩm, đệm phosphate gần như có mặt ở khắp nơi. Đệm này không hấp thụ UV ở bước sóng trên 200 nm, giữ pH ổn định và rất rẻ. Điểm yếu của nó là muối phosphate dễ kết tủa khi gặp nhiều dung môi hữu cơ. Phần lớn các ca tắc cột, kẹt van một chiều mà khách hàng nhờ chúng tôi xem đều bắt nguồn từ đây.

Đệm phosphate dùng được ở pH nào

Axit photphoric có ba nấc phân li, hai nấc dùng được trong HPLC là pKa khoảng 2,1 và khoảng 7,2. Đệm chỉ có tác dụng tốt trong khoảng ±1 đơn vị quanh pKa, nên vùng dùng được là pH 1,1 đến 3,1 và pH 6,2 đến 8,2. Pha đệm ở pH 4 hay pH 5 bằng phosphate thì gần như không có tác dụng đệm. Ở vùng đó nên chuyển sang đệm acetat.

Đa số cột silica thông thường chỉ chịu được pH 2 đến 8. Muốn chạy ngoài khoảng này phải dùng cột chuyên dụng.

Pha 1 lít đệm KH₂PO₄ 25 mM, pH 3,0

1. Cân 3,40 g kali dihydro photphat (KH₂PO₄) cấp phân tích, hoà tan trong khoảng 900 mL nước cất cấp HPLC.
2. Nhúng điện cực pH (đã hiệu chuẩn ở pH 4,01 và 7,00, hoặc tốt hơn là thêm điểm pH 2) và nhỏ từ từ axit photphoric cho đến pH 3,0.
3. Chuyển vào bình định mức 1000 mL, thêm nước tới vạch.
4. Lọc qua màng 0,45 µm, hoặc 0,22 µm nếu dùng cột hạt nhỏ hơn 3 µm.

Một điều rất hay bị làm sai là chỉnh pH sau khi đã trộn Methanol hay Acetonitrile vào. Điện cực pH đo trong hỗn hợp có dung môi hữu cơ cho ra số không còn ý nghĩa như pH trong nước, và kết quả sẽ khác nhau giữa các lần pha. Luôn chỉnh pH phần nước trước, rồi mới trộn với dung môi hữu cơ, và ghi rõ cách pha trong phương pháp.

Giới hạn dung môi hữu cơ

Muối phosphate tan kém trong dung môi hữu cơ. Với đệm kali phosphate khoảng 25 mM, kết tủa thường bắt đầu xuất hiện khi tỉ lệ Acetonitrile vượt khoảng 70%. Methanol cho phép cao hơn một chút, nhưng cũng không nên vượt khoảng 80%. Nồng độ đệm càng cao thì ngưỡng này càng thấp.

Khi chạy gradient, hãy để kênh hữu cơ có lẫn một ít nước, hoặc giới hạn điểm cuối gradient dưới ngưỡng trên. Trước khi đưa vào máy, có thể thử nhanh bằng cách trộn đệm và dung môi theo tỉ lệ cao nhất trong ống nghiệm rồi để 30 phút. Thấy đục là phải điều chỉnh lại.

Rửa hệ thống sau khi chạy

Không bao giờ chuyển thẳng từ pha động có đệm sang 100% dung môi hữu cơ, vì muối sẽ kết tủa ngay trong cột. Quy trình chúng tôi khuyên dùng như sau:

1. Rửa cột bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ cùng tỉ lệ với pha động nhưng không có đệm, khoảng 10 đến 20 thể tích cột.
2. Tăng dần lên 80% hoặc 100% dung môi hữu cơ để cất cột.
3. Các kênh bơm đã dùng đệm cũng phải chạy nước rửa, và phải rửa piston (seal wash) nếu máy có chức năng này.

Mấy lưu ý khác

Đệm phosphate là môi trường tốt cho vi sinh vật phát triển. Đệm pha xong nên dùng trong 2 đến 3 ngày, và khi hết thì thay chai mới chứ không đổ thêm vào chai cũ. Thấy đệm có vẩn hoặc váng thì bỏ.

Phosphate không bay hơi nên không dùng được cho LC-MS. Nếu phương pháp cần chuyển sang LC-MS, hãy thay bằng đệm amoni format hoặc amoni acetat.